Entwicklung eines photostabilen Cyaninfarbstoffs für funktionelle DNA-Sonden sowie DNA-modifizierte Upconversion-Nanopartikel

Die Bioanalytik bildet die Grundlage für das Verständnis der Prozesse unserer DNA und RNA. Der Weiterentwicklung bioanalytischer Methoden kommt daher eine große Bedeutung zu. Im Rahmen dieser Arbeit werden zwei Arten fluoreszenter DNA-Sonden weiterentwickelt und auf ihre Anwendbarkeit für bioanalytische Methoden untersucht. Der Hauptteil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung des klickbaren Cyaninfarbstoffs CyIQ (Cyanine Indole Quinoline), dem Aufbau funktioneller DNA-Sonden und dem bioanalytischen Einsatz dieser Sonden. Zunächst wurde eine Synthesestrategie entwickelt mit der CyIQ postsynthetisch an jede beliebige Stelle der DNA verknüpft werden kann. Dazu wurde der Farbstoff mit einem kurzen Propylazid-Linker versehen, über den durch eine kupferkatalysierte Huisgen-Cycloaddition der Chromophor an ein alkinmodifiziertes Uridin verknüpft werden kann. Die Klick-Konjugation von CyIQ verläuft dabei mit Ausbeuten über 70 % und der Farbstoff bleibt stabil. Im Vergleich zu einem Einbau während der DNA-Festphasen-synthese wird dabei nur ein Zehntel an Farbstoffsubstanz benötigt. Kovalent in DNA gebunden zeigt CyIQ eine breite Absorptionsbande zwischen λ = 400 nm und 550 nm mit einem Maximum bei 495 nm. Der Extinktionskoeffizient bewegt sich dabei typischerweise bei ε495 = 60.000 L mol-1 cm-1. Angeregt bei λexc = 495 nm fluoresziert CyIQ typischerweise im Bereich von λ = 500 – 700 nm mit einem Maximum bei λ = (560 ± 10) nm. Die Emission erfolgt also mit einer Stokes-Verschiebung von ca. λ = 75 nm. Die Fluoreszenzquantenausbeuten bewegen sich bei Einfacheinbauten um 8 %. Mit einer durchschnittlichen Helligkeit von 5600 ist CyIQ mit Thiazolorange vergleichbar, erreicht aber nur ein Drittel der Helligkeit von Cy3 in vergleichbaren DNA-Strängen. Nach Untersuchung der Redoxeigenschaften hat sich gezeigt, dass CyIQ in der Lage ist Guanin zu oxidieren. In Titrationsexperimetne steigt die Fluoreszenz von CyIQ um das siebzenfache an. Mit Ethidiumbromid erhält man in vergleichbaren Experimenten nur einen zehnfachen Anstieg. Ein wichtiges Kriterium in bioanlytischen Anwendungen ist die Photostabilität eines Chromophors. Daher wurde CyIQ mit Cy3, Thiazolrot, Thiazolorange, BODIPY und Fluorescein in DNA verglichen. Nach 30-minütiger Bestrahlung sind von CyIQ und Cy3 immer noch über 90 % der ursprünglichen Fluoreszenz vorhanden wobei die anderen Farbstoffe bereits zur Hälfte oder ganz ausgeblichen sind. Erst nach zwanzigstündiger Bastrahlung sind nur noch 20 % der CyIQ-Emission vorhanden. Im Anschluss wurden eine ganze Reihe unterschiedlicher DNA-Sonden mit Farbstoff-Dimeren synthetisiert und deren photophysikalische Wechselwirkungen untersucht. Darunter auch FRET-Sonden aus CyIQ und Thiazolrot, da sich CyIQ durch seine relativ große Stokes Verschiebung gut als FRET-Donor eignet. Der beste Erfolg konnte jedoch mit einem CyIQ-Dimer in einer Intrastrang Anordnung erzielt werden. Dabei ist die Fluoreszenz der Sonde im Einzelstrang stark gelöscht. Erst durch Hybridisierung mit dem korrekten Gegenstrang zeigt die Sonde intensive Fluoreszenz. Mit dieser Sonde war es möglich Basenfehlpaarungen in DNA über den Bereich eines ganzen Codons zu detektieren, was CyIQ für die Erkennung von Einzelbasenpolymorphismen (SNPs) interessant macht. Abschließend wurde eine CyIQ-DNA-Sonde erstmals in einem korrelativen Ansatz aus Licht- und Elektronenmikroskopie im Bereich der analytischen Zellbiologie eingesetzt. Dabei gelang es in Echtzeit am Fluoreszenzmikroskop den Weg der DNA, eingehüllt in Lipoplexe, in Zellen zu verfolgen. Da CyIQ durch eine photoinduzierte Reaktion mit Diaminobenzidin eine lokale Polymerisation initiiert, war es anschließend möglich unter dem Elektronenmikroskop in Zellschnitten die exakte Position der Sonde auf ihrem Weg vom Extrazellulärraum bis hin zum Zellkern zu verfolgen. Die Sonde wird derzeit am Tiermodell validiert. Fazit: Es konnte gezeigt werden, dass CyIQ schnell, postsynthetisch und mit geringem Einsatz von Substanz an beliebige Stellen von Oligomeren geklickt werden kann. Dabei zeigt CyIQ interessante photophysikalische Eigenschaften. Die Kombination aus hoher Photostabilität und großer Stokes Verschiebung macht CyIQ zu einer interessanten Alternative zu Fluorescein, FAM™, Atto® 495 bzw. 520, Alexa Fluor 500® , Thiazolorange und vergleichbaren Farbstoffen. Aus ersten bioanalytischen Versuchen geht hervor, dass sich CyIQ-DNA-Sonden gut für fluoreszenzmikroskopsiche oder korrelative Anwendungen aus Licht- und Elektronenmikroskopie eignen. Auch ein Einsatz in der DNA-Analytik ist denkbar. Die Verknüpfung über ein Uridin schafft zusätzlich die Möglichkeit der Übertragung auf RNA, was das Anwendungsspektrum des Fluorophors zusätzlich erweitert. Im zweiten Teil dieser Arbeit wird eine Methode zur Funktionalisierung von Upconversion Nanopartikeln mit DNA entwickelt, die ebenfalls auf der kupferkatalysieten1,3-Dipolaren Cycloaddition zwischen Alkinen mit Aziden beruht. Dafür wurden Oligomere am 3´- oder 5´-Ende mit einem 2´-O-Propargyluridin synthetisiert und an die azidmodifizierte Oberfläche von Upconversion Nanopartikeln verknüpft. Die erfolgreiche Konjugation konnte durch IR-Spektroskopie, Hybridisierungsversuche und Anfärbung mit Ethidiumbromid nachgewiesen werden. Die Aufreinigung der Nanopartikel-Konjugate und die Abtrennung überschüssiger Oligomere erfolgt durch eine Temperaturoptimierte Gelpermeationschromatographie (GPC). Die herausragende Eigenschaft von Upconversion Materialien ist deren Emission im Sichtbaren, bei Anregung im Infraroten Spektralbereich. Diese Eigenschaft macht Upconversion-Nanopartikel interessant für bioanalytische Anwendungen was auch für die DNA-funktionalisierten Partikel überprüft wurde. Dabei konnte gezeigt werden dass sowohl unmodifizierte als auch DNA-modifizierte Upconversion-Nanopartikel in der Lage sind Zellmembranen zu überwinden und dabei deutliche Fluoreszenzsignale liefern. DNA verleiht den Nanopartikeln eine sequenzspezifische Erkennbarkeit. Diese Möglichkeit der molekularen Erkennung wurde durch DNA-gesteuerte Aggregation komplementärer Nanopartikel nachgewiesen. Besonders eindrucksvoll ist die Aggregation zu flockigen Niederschlägen bei Zugabe einer Ziel-DNA zu nicht komplementären Nanopartikeln. In Cytotoxizitäts-Assays stellte sich schließlich heraus, das die in dieser Arbeit verwendeten DNA-modifizierten Upconversion-Nanopartikel toxischer sind als unmodifizierte. Als Hauptgrund werden verschleppte Kupferionen der Klick-Reaktion diskutiert. Dieses Ergebnis liefert wichtige Erkenntnisse für den stetig wachsenden Einsatz der Klick-Konjugation in bioanalytischen Systemen. Bei zukünftigen Anwendungen dieser Reaktion muss dieses Problem berücksichtigt werden und gegebenenfalls auf etablierte Methoden oder Kupfer freie Klick-Reaktionen, z. B. über Cyclooctine zurückgegriffen werden. Prinzipiell konnte jedoch gezeigt werden, dass Upconversion-Nanopartikel durch die Kombination mit DNA zusätzliche Funktionen erhalten und dadurch ihr Anwendungsspektrum erweitern können

Soccer: is scoring goals a predictable Poissonian process?

The non-scientific event of a soccer match is analysed on a strictly scientific level. The analysis is based on the recently introduced concept of a team fitness (Eur. Phys. J. B 67, 445, 2009) and requires the use of finite-size scaling. A uniquely defined function is derived which quantitatively predicts the expected average outcome of a soccer match in terms of the fitness of both teams. It is checked whether temporary fitness fluctuations of a team hamper the predictability of a soccer match. To a very good approximation scoring goals during a match can be characterized as independent Poissonian processes with pre-determined expectation values. Minor correlations give rise to an increase of the number of draws. The non-Poissonian overall goal distribution is just a consequence of the fitness distribution among different teams. The limits of predictability of soccer matches are quantified. Our model-free classification of the underlying ingredients determining the outcome of soccer matches can be generalized to different types of sports events

Exploiting Sparse Representations for Robust Analysis of Noisy Complex Video Scenes

Abstract. Recent works have shown that, even with simple low level visual cues, complex behaviors can be extracted automatically from crowded scenes, e.g. those depicting public spaces recorded from video surveillance cameras. However, low level features as optical flow or fore-ground pixels are inherently noisy. In this paper we propose a novel unsupervised learning approach for the analysis of complex scenes which is specifically tailored to cope directly with features ’ noise and uncer-tainty. We formalize the task of extracting activity patterns as a matrix factorization problem, considering as reconstruction function the robust Earth Mover’s Distance. A constraint of sparsity on the computed basis matrix is imposed, filtering out noise and leading to the identification of the most relevant elementary activities in a typical high level behavior. We further derive an alternate optimization approach to solve the pro-posed problem efficiently and we show that it is reduced to a sequence of linear programs. Finally, we propose to use short trajectory snippets to account for object motion information, in alternative to the noisy optical flow vectors used in previous works. Experimental results demonstrate that our method yields similar or superior performance to state-of-the arts approaches.

HLA-J, a Non-Pseudogene as a New Prognostic Marker for Therapy Response and Survival in Breast Cancer

The human leukocyte antigen (HLA) genes are cell-surface proteins, essential for immune cell interaction. HLA-G is known for their high immunosuppressive effect and its potential as predictive marker in breast cancer. However, nothing is known about the HLA-J and its immunosuppressive, prognostic and predictive features, as it is assumed to be a pseudogene by in silico sequence interpretation. HLA-J, ESR1, ERBB2, KRT5 and KRT20 mRNA expression were analysed in 29 fresh frozen breast cancer biopsies and their corresponding resectates obtained from patients treated with neoadjuvant chemotherapy (NACT). mRNA was analysed with gene specific TaqMan-based Primer/Probe sets and normalized to Calmodulin 2. All breast cancer samples did express HLA-J and frequently increased HLA-J mRNA levels after NACT. HLA-J mRNA was significantly associated with overexpression of the ESR1 mRNA status (Spearman ρ 0,5679; p = 0.0090) and KRT5 mRNA (Spearman ρ 0,6121; p = 0.0041) in breast cancer core biopsies and dominated in luminal B subtype. Kaplan Meier analysis revealed that an increase of HLA-J mRNA expression after NACT had worse progression free survival (p = 0,0096), indicating a counterreaction of tumor tissues presumably to prevent elimination by enhanced immune infiltration induced by NACT. This counterreaction is associated with worse prognosis. To our knowledge this is the first study identifying HLA-J as a new predictive marker in breast cancer being involved in immune evasion mechanisms.Humane Leukozyten-Antigene (HLA) sind Proteine auf der Zelloberfläche, die essenziell für die Immunzellinteraktion sind. HLA-G ist für seine hohe immunosuppressive Wirkung sowie als potenzieller prädikativer Marker für Brustkrebs bekannt. Dagegen ist kaum etwas über HLA-J und seine immunosuppressiven, prognostischen und prädiktiven Eigenschaften bekannt, da es basierend auf In-silico-Sequenzanalysen als „Pseudogen“ interpretiert wurde. Die Expression von HLA-J, ESR1, ERBB2, KRT5 und KRT20 mRNA wurde in 29 frisch gefrorenen Brustkrebsbiopsien analysiert und mit den klinisch-pathologischen Daten von Patientinnen, welche mit neoadjuvanter Chemotherapie behandelt wurden, verglichen. Die mRNA-Expression wurde mit genspezifischen TaqMan-basierten Primer/Probe-Sets analysiert und auf Calmodulin 2 normalisiert. Alle Gewebeproben von Patientinnen mit Brustkrebs exprimierten HLA-J, und der HLA-J-mRNA-Spiegel war nach NACT oft erhöht. In den Brustkrebsstanzbiopsien war die HLA-J-mRNA-Expression signifikant mit der Überexpression von ESR1-mRNA (Spearmans ρ 0,5679; p = 0,0090) und KRT5-mRNA (Spearmans ρ 0,6121; p = 0,0041) assoziiert und dominierte im Luminal-B-Subtyp. Die Kaplan-Meier-Analyse zeigte, dass ein Anstieg der HLA-J-mRNA-Expression nach NACT mit einem schlechteren progressionsfreien Überleben einhergeht (p = 0,0096), womöglich als Gegenreaktion des Tumorgewebes, um eine Eliminierung durch tumorinfiltrierende Lymphozyten, welche durch eine NACT induziert wurden, zu verhindern. Diese Gegenreaktion ist mit einer schlechteren Prognose assoziiert. Soweit uns bekannt, handelt es sich hierbei um die erste Studie, die HLA-J als neuen prädiktiven Marker im Brustkrebs identifiziert hat und möglicherweise zur Immunevasion beiträgt

Layer-by-layer functionalized nanotube arrays: A versatile microfluidic platform for biodetection

We demonstrate the layer-by-layer (LbL) assembly of polyelectrolyte multilayers (PEM) on three-dimensional nanofiber scaffolds. High porosity (99%) aligned carbon nanotube (CNT) arrays are photolithographically patterned into elements that act as textured scaffolds for the creation of functionally coated (nano)porous materials. Nanometer-scale bilayers of poly(allylamine hydrochloride)/poly(styrene sulfonate) (PAH/SPS) are formed conformally on the individual nanotubes by repeated deposition from aqueous solution in microfluidic channels. Computational and experimental results show that the LbL deposition is dominated by the diffusive transport of the polymeric constituents, and we use this understanding to demonstrate spatial tailoring on the patterned nanoporous elements. A proof-of-principle application, microfluidic bioparticle capture using N-hydroxysuccinimide-biotin binding for the isolation of prostate-specific antigen (PSA), is demonstrated.National Science Foundation (U.S.) (Award DMR-0819762

Activated Polymorphonuclear Leukocytes Rapidly Synthesize Retinoic Acid Receptor-α: A Mechanism for Translational Control of Transcriptional Events

In addition to releasing preformed granular proteins, polymorphonuclear leukocytes (PMNs) synthesize chemokines and other factors under transcriptional control. Here we demonstrate that PMNs express an inducible transcriptional modulator by signal-dependent activation of specialized mechanisms that regulate messenger RNA (mRNA) translation. HL-60 myelocytic cells differentiated to surrogate PMNs respond to activation by platelet activating factor by initiating translation and with appearance of specific mRNA transcripts in polyribosomes. cDNA array analysis of the polyribosome fraction demonstrated that retinoic acid receptor (RAR)-α, a transcription factor that controls the expression of multiple genes, is one of the polyribosome-associated transcripts. Quiescent surrogate HL60 PMNs and primary human PMNs contain constitutive message for RAR-α but little or no protein. RAR-α protein is rapidly synthesized in response to platelet activating factor under the control of a specialized translational regulator, mammalian target of rapamycin, and is blocked by the therapeutic macrolide rapamycin, events consistent with features of the 5′ untranslated region of the transcript. Newly synthesized RAR-α modulates production of interleukin-8. Rapid expression of a transcription factor under translational control is a previously unrecognized mechanism in human PMNs that indicates unexpected diversity in gene regulation in this critical innate immune effector cell

Does the history of food energy units suggest a solution to "Calorie confusion"?

The Calorie (kcal) of present U.S. food labels is similar to the original French definition of 1825. The original published source (now available on the internet) defined the Calorie as the quantity of heat needed to raise the temperature of 1 kg of water from 0 to 1°C. The Calorie originated in studies concerning fuel efficiency for the steam engine and had entered dictionaries by 1840. It was the only energy unit in English dictionaries available to W.O. Atwater in 1887 for his popular articles on food and tables of food composition. Therefore, the Calorie became the preferred unit of potential energy in nutrition science and dietetics, but was displaced when the joule, g-calorie and kcal were introduced. This article will explain the context in which Nicolas Clément-Desormes defined the original Calorie and the depth of his collaboration with Sadi Carnot. It will review the history of other energy units and show how the original Calorie was usurped during the period of international standardization. As a result, no form of the Calorie is recognized as an SI unit. It is untenable to continue to use the same word for different thermal units (g-calorie and kg-calorie) and to use different words for the same unit (Calorie and kcal). The only valid use of the Calorie is in common speech and public nutrition education. To avoid ongoing confusion, scientists should complete the transition to the joule and cease using kcal in any context

Conformance checking using activity and trace embeddings

Conformance checking describes process mining techniques used to compare an event log and a corresponding process model. In this paper, we propose an entirely new approach to conformance checking based on neural network-based embeddings. These embeddings are vector representations of every activity/task present in the model and log, obtained via act2vec, a Word2vec based model. Our novel conformance checking approach applies the Word Mover’s Distance to the activity embeddings of traces in order to measure fitness and precision. In addition, we investigate a more efficiently calculated lower bound of the former metric, i.e. the Iterative Constrained Transfers measure. An alternative method using trace2vec, a Doc2vec based model, to train and compare vector representations of the process instances themselves is also introduced. These methods are tested in different settings and compared to other conformance checking techniques, showing promising results

Long-term coding of personal and universal associations underlying the memory web in the human brain

Neurons in the medial temporal lobe (MTL), a critical area for declarative memory, have been shown to change their tuning in associative learning tasks. Yet, it is unclear how durable these neuronal representations are and if they outlast the execution of the task. To address this issue, we studied the responses of MTL neurons in neurosurgical patients to known concepts (people and places). Using association scores provided by the patients and a web-based metric, here we show that whenever MTL neurons respond to more than one concept, these concepts are typically related. Furthermore, the degree of association between concepts could be successfully predicted based on the neurons’ response patterns. These results provide evidence for a long-term involvement of MTL neurons in the representation of durable associations, a hallmark of human declarative memory